2019年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《世界視覺(jué)報(bào)告》指出，全球至少22億的視力損傷患者中與角膜有關(guān)的未矯正屈光不正約有1.27億，角膜渾濁約有420萬(wàn)[1]。角膜是位于眼球最前端的透明圓頂形結(jié)構(gòu)，作為前屏障，角膜保護(hù)其他所有眼球結(jié)構(gòu)，使其免受外部損傷。角膜也是透光和分光的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，光線(xiàn)的透射和折射在很大程度上依賴(lài)于角膜的透明度和曲率[2]，因此角膜也是視覺(jué)形成的關(guān)鍵組織。
干細(xì)胞治療屬于再生醫(yī)學(xué)范疇，其應(yīng)用于臨床實(shí)踐的首要目標(biāo)是利用干細(xì)胞重建功能性組織。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出和發(fā)展，干細(xì)胞治療也進(jìn)入了新的精細(xì)階段，針對(duì)角膜各組分的干細(xì)胞重建取得了進(jìn)展。
角膜上皮重建是干細(xì)胞治療的主戰(zhàn)場(chǎng)，角膜上皮維持著角膜的無(wú)血管和相對(duì)脫水狀態(tài)，使角膜透明和完整而保持清晰的視力。角膜上皮的生理來(lái)源是角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSCs)，LSC屬成體干細(xì)胞，通過(guò)連續(xù)不對(duì)稱(chēng)地分裂、分化，并向角膜中心遷移，以補(bǔ)充脫落的角膜上皮細(xì)胞[3]。
圖1 角膜表面重建
角膜緣干細(xì)胞缺乏癥 (limbal stem cell deficiency，LSCD)指角膜緣干細(xì)胞的缺失或功能障礙，表現(xiàn)為角膜新生血管和結(jié)膜化，可通過(guò)對(duì)眼表細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移、印跡和免疫染色，即印跡細(xì)胞學(xué)(impression cytology)驗(yàn)證[4]。LSCD的臨床癥狀包括慢性眼表不適、視力下降、畏光等，病因可分為2類(lèi)：外在原因，如化學(xué)燒傷、放射線(xiàn)和感染等；內(nèi)在原因，如Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnson syndrome，SJS)、無(wú)虹膜、單純皰疹性角膜炎和慢性角膜緣炎等。對(duì)于角膜中心部分相對(duì)透明的部分LSCD，應(yīng)選擇保守措施進(jìn)行治療[5]，而對(duì)于較嚴(yán)重或完全的LSCD病例，通過(guò)移植手術(shù)補(bǔ)充角膜緣干細(xì)胞則被考慮為主要的治療方法。傳統(tǒng)的LSCD移植治療方法主要包括結(jié)膜角膜緣自體移植(conjunctival limbal autograft，CLAU)、角膜緣異體移植(limbal allograft，LAL)以及人工角膜移植。
表1 干細(xì)胞移植重建角膜上皮方法的優(yōu)缺點(diǎn)
角膜基質(zhì)約占角膜厚度的90%，主要由I型和V型膠原纖維片層狀排列組成[6]，為角膜提供了結(jié)構(gòu)支撐和抗拉強(qiáng)度、穩(wěn)定性和透明等重要特性。角膜基質(zhì)細(xì)胞位于角膜緣片層之間產(chǎn)生膠原蛋白和蛋白多糖，從而有助于角膜基質(zhì)的穩(wěn)定、細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)以及愈合過(guò)程[7]。在角膜損傷修復(fù)過(guò)程中，角膜基質(zhì)細(xì)胞容易變性轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，且此過(guò)程不可逆轉(zhuǎn)，通常會(huì)造成角膜的混濁。
角膜基質(zhì)干細(xì)胞存在于角膜緣基質(zhì)中，能通過(guò)基底膜與角膜緣干細(xì)胞有直接的細(xì)胞連接，為角膜緣干細(xì)胞提供支持維持其干細(xì)胞特性[8]。角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)和干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志物(CD73、CD90、CD105、CD140b)，能夠在體外分化為脂肪、骨和軟骨。研究人員成功從角膜緣上層組織中分離出角膜基質(zhì)干細(xì)胞，可形成表達(dá)干細(xì)胞基因(ABCG2、Nestin、NGFR、Oct4、PAX6和Sox2)的克隆球，并且能進(jìn)一步分化為表達(dá)ALDH3A1、AQP1、KERA和PTGDS等標(biāo)志基因的角膜基質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)移植到小鼠角膜傷口中時(shí)，角膜基質(zhì)干細(xì)胞可防止光散射瘢痕組織的形成。此外，角膜中注射分離的角膜基質(zhì)干細(xì)胞，可以恢復(fù)角膜基質(zhì)的透明度和結(jié)構(gòu)，其外泌體也對(duì)受傷角膜起促進(jìn)愈合的作用。除了角膜基質(zhì)的原生干細(xì)胞外，來(lái)源于骨髓、臍帶、脂肪組織、人羊膜的其他間質(zhì)干細(xì)胞以及iPSCs治療也能防止受傷角膜基質(zhì)的不透明和新生血管。干細(xì)胞能通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)愈合：向角膜基質(zhì)細(xì)胞分化、抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能、免疫調(diào)節(jié)、防止異常細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積、優(yōu)選產(chǎn)生正常ECM成分、釋放旁分泌因子影響周?chē)鷵p傷細(xì)胞和正常細(xì)胞來(lái)防止角膜瘢痕。盡管角膜基質(zhì)干細(xì)胞的研究在近期獲得了一些進(jìn)展，但距離真正的角膜基質(zhì)層重建還有一定距離，需要克服細(xì)胞純度、細(xì)胞特征鑒定、細(xì)胞移植術(shù)式建立等一系列困難[9]。
角膜內(nèi)皮細(xì)胞是神經(jīng)嵴衍生的細(xì)胞，位于特殊的細(xì)胞外基質(zhì)上，維持著角膜基質(zhì)水合所必需的狹窄生理范圍，同時(shí)通過(guò)離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能抵消了從基質(zhì)到房水的擴(kuò)散梯度并進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)角膜功能的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)法再生，受損后細(xì)胞通常會(huì)發(fā)生變形、變大，但整體數(shù)量相應(yīng)減少，導(dǎo)致角膜內(nèi)皮功能失代償。當(dāng)細(xì)胞密度低于維持其生理功能的臨界密度，將發(fā)生嚴(yán)重的病理改變。體外獲得角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的技術(shù)還不成熟，只有少數(shù)研究開(kāi)發(fā)了獲得具備角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞特征細(xì)胞的體外方法，應(yīng)用細(xì)胞移植技術(shù)治療角膜內(nèi)皮疾病的報(bào)導(dǎo)較少。2018年，研究人員將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的異體內(nèi)皮細(xì)胞注射到11例大皰性角膜病患者前房。24周的隨訪(fǎng)后接受治療的眼睛的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度均超過(guò)500個(gè)細(xì)胞/mm2，其中10個(gè)超過(guò)1000個(gè)細(xì)胞/mm2，且沒(méi)有發(fā)生任何不良事件。該臨床試驗(yàn)表明了細(xì)胞移植技術(shù)治療角膜內(nèi)皮疾病是可行的。牙髓干細(xì)胞也被證明可轉(zhuǎn)化為表達(dá)ZO1、ATP1A1以及COL4A2等角膜內(nèi)皮特異性標(biāo)志物的細(xì)胞，有望作為角膜內(nèi)皮細(xì)胞的替代細(xì)胞[10]。
近30年角膜領(lǐng)域新技術(shù)使數(shù)百萬(wàn)患者免于失明，但利用角膜緣干細(xì)胞重建功能性角膜仍需深入研究，如鑒定更多的特異性干細(xì)胞標(biāo)志物，包括細(xì)胞表面標(biāo)志物以檢測(cè)和富集干細(xì)胞群體；研發(fā)維持角膜緣干細(xì)胞擴(kuò)增的穩(wěn)定體系，避免細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中增殖能力減弱；此外，應(yīng)著力解決諸如大規(guī)模無(wú)異種蛋白(Xeno-free)培養(yǎng)、干細(xì)胞治療GMP通用化以及低不良反應(yīng)高效免疫抑制等瓶頸問(wèn)題。角膜基質(zhì)和角膜內(nèi)皮的干細(xì)胞治療相比角膜上皮仍處于不成熟階段。角膜基質(zhì)干細(xì)胞缺乏國(guó)際范圍內(nèi)認(rèn)可的特異性標(biāo)志物，臨床試驗(yàn)尚未開(kāi)展。角膜內(nèi)皮細(xì)胞則需要尋找種子細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)“開(kāi)源”，同時(shí)也需要發(fā)展成熟的干細(xì)胞治療方
案來(lái)實(shí)現(xiàn)科研和臨床的同步。
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